本制品是基于新型的具有细胞膜通透性的Caspase-3/7绿色荧光底物GreenDevd Caspase-3 Substrate联合细胞凋亡红色荧光探针Annexin V-mCherry来检测细胞球或类器官中Caspase-3酶活性和细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸的一种红绿荧光双染细胞凋亡检测试剂盒。
本试剂盒可快速、便捷地检测3D培养的细胞球或类器官中凋亡细胞内Caspase-3酶活性和凋亡以及坏死细胞的细胞膜红色荧光染色，可用于实时监测活细胞中Caspase-3活性和凋亡情况。仅需染色15分钟，就可在荧光显微镜下观察到凋亡细胞中非常明亮的细胞膜红色荧光染色和细胞核绿色荧光染色，而坏死细胞仅呈现细胞膜红色荧光染色。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。
本试剂盒检测的是GreenDevd-DNA复合物的绿色荧光和Annexin V-mCherry红色荧光，GreenDevd-DNA的最大激发光波长为500nm，最大发射光波长为530nm；Annexin V-mCherry的最大激发光波长为587nm，最大发射光波长为610nm。
正常细胞不会被GreenDevd和Annexin V-mCherry所染色，Caspase-3活性高的凋亡细胞的细胞核呈明亮的绿色荧光，凋亡细胞会被Annexin V-mCherry染成红色荧光。
在正常活细胞中，磷酯酰丝氨酸(PS)位于细胞膜的近细胞质面。而在凋亡细胞中，PS从质膜的内部外翻到细胞表面即细胞膜外侧，从而使PS暴露于细胞外部。在白细胞的凋亡过程中，白细胞表面的PS标记可以被巨噬细胞识别，从而最终被巨噬细胞吞噬。人血管抗凝血剂Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，分子量为35～36kDa，对PS具有高亲和力。用Annexin V-mCherry染色细胞，就可以通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪等荧光检测设备非常简单而直接地检测到PS的外翻这一细胞凋亡的重要特征。需要指出的是对于发生坏死(Necrosis)的细胞，由于细胞膜的完整性被破坏，位于细胞膜内侧的PS也会被Annexin V-mCherry染色。
GreenDevd Caspase-3 Substrate为耦合DNA绿色荧光染料的多肽DEVD，该底物中的DEVD是caspase 3/7的识别序列，并带有大量负电荷。这些负电荷和DNA带有的负电荷相互排斥，使底物中的DNA绿色荧光染料不能结合DNA，也就不能被激发产生绿色荧光。最初没有荧光的底物穿过细胞膜进入细胞质，在凋亡细胞中被Caspase-3/7识别并剪切，释放出活化的DNA绿色荧光染料分子。活化的DNA绿色荧光染料分子迁移进入细胞核，与DNA结合后，形成GreenDevd-DNA复合物，就可以被激发而产生明亮的绿色荧光。
- 本试剂盒检测可以实时监测细胞内Caspase-3/7活性。传统的Caspase活性检测试剂盒，通常需要裂解细胞或组织样品后进行显色或荧光检测；通过Western检测Caspase本身的和剪切后的蛋白表达情况，也只能检测Caspase的表达情况，从一定程度上反映酶活性；基于荧光标记的Caspase抑制剂的检测技术(FLICA)可以进入活细胞检测Caspase活性，但其荧光探针本身就是不可逆的Caspase抑制剂，所以无法在活细胞中实时监测Caspase的活力。而本试剂盒中提供的荧光底物GreenDevd Caspase-3对细胞活性没有明显的抑制作用，不影响Caspase的表达，不抑制细胞的凋亡过程，有助于实时监测细胞凋亡。
- 本试剂盒功能强大。使用本试剂盒检测Caspase-3/7的活性的同时，可以实时观察细胞核在凋亡过程中的形态学变化，还能够检测细胞凋亡过程中PS外翻这一经典事件。在众多凋亡的细胞内，不同细胞可能处在不同阶段并经历着凋亡过程中的不同事件，因而研究中很重要的一点就是能实时独立地跟踪这些事件，从而更好地了解事件之间的相互关系。本试剂盒可以通过荧光显微镜等来研究这些不同事件的时间、空间关系。
- 本试剂盒适用范围广。本试剂盒可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。
- 本试剂盒使用便捷，整个检测过程仅需约15～30分钟即可完成。3D细胞球经凋亡、坏死等诱导处理后，将本试剂盒中的By3D Annexin V-mCherry(40×)和By3D GreenDevd Caspase-3 Substrate(100×)按照相应比例用By3D Annexin V-mCherry Binding Buffer配制成By3D Annexin V-mCherry/GreenDevd Caspase-3 Substrate检测工作液，避光孵育15分钟，就可进行后续的荧光显微镜拍照等荧光检测和分析。
| 组分 | 20T | 50T |
| By3D Annexin V-mCherry(40×) | 50μL | 125μL |
| By3D GreenDevd Caspase-3 Substrate(100×) | 20μL | 50μL |
| By3D Annexin V-mCherry Binding Buffer | 2mL | 5mL |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
- GreenDevd Caspase-3 Substrate不是很稳定，应尽量避免反复冻融(通常不要超过三次)。
- 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 不同种类的细胞球对凋亡或坏死诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经凋亡或坏死诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。
- 如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。
- 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
- 荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
- 如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解By3D Annexin V-mCherry，导致染色失败。
本步骤以96孔板，每孔接种100μL细胞为例，如使用其它类型的多孔板，各试剂使用量请按照相应比例进行换算。
- 3D细胞的准备：
在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板，或直接使用GoldBalb超低吸附96孔板(YTC4962或YTC4961)、超低吸附黑色透明底96孔板等。- 为达到最佳的染色效果，具体的细胞球培养时间、药物等干预时间可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行干预和染色效果较好。
- 3D细胞染色：
- 检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- 检测工作液的配制：如下表所示，按照每孔需要100μL检测工作液的量，用By3D Annexin V-mCherry Binding Buffer稀释配制适量的检测工作液。
样品数 10个样品 20个样品 50个样品 By3D Annexin V-mCherry (40×) 25μL 50μL 125μL By3D GreenDevd Caspase-3 Substrate(100×) 10μL 20μL 50μL By3D Annexin V-mCherry Binding Buffer 965μL 1.93mL 4.825mL 检测工作液 1mL 2mL 5mL - 配制好的检测工作液必须一次使用完毕，不能冻存。
- 检测工作液中的Annexin V-mCherry和GreenDevd Caspase-3 Substrate的最终浓度可以根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。Annexin V-mCherry和GreenDevd Caspase-3 Substrate的工作浓度通常为0.5～2×，推荐使用浓度为1×。
- 染色：小心吸除原有细胞培养液，沿着孔壁缓慢加入100μL检测工作液，在适宜于细胞培养的温度避光孵育15分钟。
- 为达到最佳的染色效果，具体染色时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常位于在培养板或培养皿等培养器皿的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 如有必要后续可以使用3D细胞Hoechst 33342染色液等进行染色。
- 检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- 荧光检测：
- 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察荧光染色效果。注意整个过程均需注意避光操作。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 荧光酶标仪检测：孵育结束后，小心吸除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后用荧光酶标仪检测(GreenDevd-DNA为绿色荧光，Ex/Em=500/530nm；Annexin V-mCherry为红色荧光，Ex/Em=587/610nm)。通过对比对照组两种荧光探针的RFU，可以计算出正常细胞与凋亡细胞的相对比例关系。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察荧光染色效果。注意整个过程均需注意避光操作。
图1.本试剂盒对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板中培养48小时，100μM Camptothecin诱导细胞球凋亡、坏死过夜，然后吸除培养液后直接加入By3D Annexin V-mCherry/GreenDevd Caspase-3 Substrate检测工作液，染色15分钟。结果显示，本试剂盒对于药物诱导凋亡、坏死后的3D细胞染色效果清晰、明亮，GreenDevd Caspase-3 Substrate染色的凋亡细胞核(B、G)和Annexin V-mCherry染色的凋亡细胞膜(C、H)可见明显差别，同时Control组无明显GreenDevd Caspase-3 Substrate和Annexin V-mCherry荧光染色(B、C)。3D细胞Hoechst 33342染色液染色的细胞核总体基本一致(D、I)。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
细胞凋亡是生物体发育等生命过程中普遍存在的、由基因决定的细胞主动有序的死亡方式。当细胞遇到内、外环境因子刺激时，启动基因调控的自杀保护措施，去除体内非必需细胞或即将发生特化的细胞。在这一过程中，细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，并迅速被巨噬细胞或邻近细胞清除，这是一种由基因控制、高度有序的细胞自主死亡，包含一系列信号事件组成的通路。细胞凋亡失调与多种疾病有关，例如阿尔茨海默病和癌症等。
Caspase全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，存在于细胞质中，主要利用半胱氨酸侧链选择性地高效切割含有天冬氨酸的多肽底物，在介导细胞凋亡(Apoptosis)过程中起重要作用，并参与细胞的炎症、生长和分化等过程。Caspase-3也称CPP32、Yama或apopain，属于caspase家族的CED-3亚家族，是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。Caspase-3是细胞凋亡过程中的一个关键酶，可以直接特异性剪切许多caspase底物，包括PARP、ICAD、proCaspase-6、7和9、gelsolin和fodrin等。这些由Caspase-3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。同时Caspase-3还参与细胞核凋亡过程，如染色质固缩，DNA片段化等。另外，Caspase-3对凋亡过程中的细胞起泡也起到了关键作用。
传统的细胞培养大多以二维(2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低。三维(3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实地反映细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果。
3D肿瘤细胞模型越来越多地被用于了解疾病机制和药物研发。2D培养的肿瘤细胞，其单侧细胞膜可以均匀地获得营养和氧气，而3D培养的肿瘤细胞团的内部细胞获得营养和氧气的机会更少，形成自然的营养和氧气梯度，能更好地模拟体内微环境条件，因此3D培养的肿瘤球状体或肿瘤类器官等能更好地模拟体内肿瘤，更利于小分子药物筛选或者肿瘤相关分子机制的研究，也更能准确地预测药物治疗的体内反应、疗效或毒性。同时，2D肿瘤细胞模型体外扩增有一定局限性，在传代后容易丧失原肿瘤的遗传异质性，出现优势克隆选择性，从而降低临床相关性。相比于2D细胞模型，3D细胞球或者类器官很多情况下能提供更可信的研究结果，简化并加速药物评价流程。自2009年小肠类器官首次建立至今，3D细胞和类器官研究已经扩展到很多组织系统，并成为生命科学最热门的领域之一。
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